ในบทความวันนี้ เราจะมาทำความรู้จักกับการหาลำดับเบสด้วยสามเทคนิค อันได้แก่

1.เทคนิค Capillary DNA Sequencing หรือ Sanger Sequencing เป็นการหาลำดับเบสโดยอาศัยการใช้ Dideoxynucleotide (ddNTPs) เป็นตัวหยุดสังเคราะห์สาย DNA โดยปฏิกิริยาในขั้นตอนการเกิด Polymerization โดยเอนไซม์ DNA Polymerase จะมีการสร้างสาย DNA จากไพร์เมอร์ ที่จับกับ DNA Template (DNA ต้นแบบ) และ Deoxynucleotide (dNTPs) ที่เติมลงไป ในการหาลำดับเบส

ขั้นตอนที่สำคัญของกระบวนการต่อสายนิวคลีโอไทด์คือ DNA chain termination โดยอาศัย dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) ซึ่งเป็นนิวคลีโอไทด์ที่ขาดหมู่ไฮดรอกซิล (-OH) ที่ตำแหน่ง 3' ส่งผลให้ การสังเคราะห์ดีเอ็นเอหยุดลง เมื่อนำ ddNTPs เข้าไปแทรก ทำให้แต่ละปฏิกิริยาจะมีชิ้นดีเอ็นเอ หลากหลายขนาดรวมกันอยู่ วิธีแซงเกอร์สามารถวิเคราะห์ลำดับเบส ได้ในช่วงประมาณ 500 ถึง 1000 คู่เบส

1 เตรียมดีเอ็นเอเป้าหมาย (Template DNA)

• นำ DNA ที่ต้องการอ่านลำดับมาผ่านกระบวนการ PCR (Polymerase Chain Reaction) เพื่อเพิ่มจำนวน

2  ผสมสารเคมีในปฏิกิริยาการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ

• ใส่ DNA polymerase
• ใส่ dNTPs (A, T, C, G) ซึ่งเป็นนิวคลีโอไทด์ปกติ
• ใส่ ddNTPs (A*, T*, C*, G*) ที่ติดฉลากฟลูออเรสเซนต์ (Fluorescent-labeled) หรือสารเรืองแสง

3 กระบวนการขยายสายดีเอ็นเอ (DNA synthesis & termination)

• DNA polymerase จะสร้างสาย DNA ใหม่จาก Template โดยเติม dNTPs
• เมื่อ ddNTPs ถูกเติมเข้าไปแทน dNTPs การสังเคราะห์จะหยุดลง ทำให้เกิด ดีเอ็นเอขนาดต่าง ๆ
• กระบวนการนี้เกิดขึ้นซ้ำ ๆ ทำให้ได้ชิ้น DNA ที่มีความยาวต่างกัน ซึ่งแต่ละชิ้นจะลงท้ายด้วย ddNTP ที่แตกต่างกัน

4 แยกชิ้นดีเอ็นเอโดย Electrophoresis หรือ Capillary Gel Electrophoresis

• ชิ้นดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ได้จะถูกนำไปวิ่งใน gel electrophoresis หรือ capillary electrophoresis
• สาย DNA ที่สั้นกว่าจะวิ่งไปไกลกว่าสายที่ยาว
• เครื่องมือจะตรวจจับสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จาก ddNTPs ที่ปลายแต่ละสาย และใช้ซอฟต์แวร์สร้างลำดับดีเอ็นเอ (Electropherogram)

📏 จุดเด่นของ Sanger Sequencing

✅ ความแม่นยำสูง (~99.99% ต่อเบส)
✅ เหมาะกับลำดับสั้น ๆ (500-1,000 bp)
✅ ใช้สำหรับยืนยันผลจาก NGS หรือ PCR
✅ ง่ายและต้นทุนไม่สูงถ้าวิเคราะห์เป้าหมายจำนวนน้อย

⚠ ข้อจำกัดของ Sanger Sequencing

❌ ความเร็วต่ำกว่า NGS (ทำได้ทีละโมเลกุล)
❌ ต้นทุนต่อเบสสูงกว่าถ้าต้องการอ่านลำดับขนาดใหญ่
❌ ไม่เหมาะกับ Whole Genome Sequencing (WGS)

🎯 การนำไปใช้ของ Sanger Sequencing

📌 การยืนยันลำดับดีเอ็นเอ (Mutation Validation)
📌 วินิจฉัยโรคทางพันธุกรรม (Genetic Testing เช่น BRCA1/BRCA2 สำหรับมะเร็งเต้านม)
📌 วิเคราะห์ยีนเดี่ยว หรือ Targeted Gene Sequencing
📌 ศึกษา SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
📌 ตรวจสอบความผิดปกติในคลินิก (Clinical Diagnostics)

🔥 สรุป

Sanger sequencing เป็นเทคนิคที่ยังคงมีบทบาทสำคัญในงานวิจัยและการแพทย์ เนื่องจาก ความแม่นยำสูงและง่ายต่อการใช้งาน เหมาะสำหรับ การยืนยันลำดับดีเอ็นเอ และการวิเคราะห์เป้าหมายเล็ก ๆ แม้ว่าเทคโนโลยี NGS จะเข้ามาแทนที่ในงานที่ต้องการวิเคราะห์จีโนมขนาดใหญ่ก็ตาม