Digital PCR และ Next-Generation Sequencing ในการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม

 การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมสามารถแบ่งออกเป็นหลายรูปแบบ ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์ของการศึกษาและเทคนิคที่ใช้วิเคราะห์ Digital PCR (dPCR) และ Next-Generation Sequencing (NGS) เป็นเทคโนโลยีที่ใช้ในการวิเคราะห์กรดนิวคลีอิก (DNA/RNA) แต่มีหลักการทำงานและการใช้งานที่แตกต่างกัน ดังนี้:

 Digital PCR (dPCR)

• dPCR คือเทคนิคที่พัฒนามากจาก PCR เนื่องจาก PCR ทั่วไป ใช้การวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนส์แบบรวม ทำให้มีข้อจำกัดในการตรวจหาตัวอย่างที่มี DNA หรือ RNA ในปริมาณต่ำ
• dPCR แบ่งตัวอย่างออกเป็นไมโครดรอปเล็ตหรือไมโครแชมเบอร์นับพัน ทำให้สามารถวัดสัญญาณของแต่ละหน่วยได้แบบแยกส่วน ลดข้อผิดพลาดจากสัญญาณรบกวน
• โดยจะมีการแบ่งตัวอย่างสารพันธุกรรมออกเป็นส่วนย่อย (partitions) ในรูปแบบหยดน้ำ (droplets) หรือช่องเล็กๆ (wells) แต่ละส่วนจะมีการทำ PCR แยกจากกัน

 ภาพ 1 การแบ่งตัวอย่างสารพันธุกรรมออกเป็นส่วนย่อย (partitions) 

ภาพ 2 แสดงกระบวนการแบ่งพาร์ติชันของตัวอย่างสำหรับ Droplet Digital PCR (ddPCR) และการแบ่งพาร์ติชันแบบกายภาพโดยใช้นาโนเวลล์
ภาพโดย: Roche Sequencing and Life Science

• ใช้ Poisson statistics เพื่อคำนวณจำนวนโมเลกุลเป้าหมายที่แท้จริง โดยพิจารณาจากจำนวนของส่วนที่มีสัญญาณบวกและลบ
• ไม่ต้องการใช้ standard curve แบบ qPCR ทำให้มีความแม่นยำและไวสูงกว่าในการตรวจหาปริมาณโมเลกุลที่มีความเข้มข้นต่ำมาก

 Next-Generation Sequencing (NGS)

• NGS ทำการ sequencing หรือการถอดรหัสลำดับเบสของ DNA หรือ RNA จำนวนมหาศาลพร้อมกันในครั้งเดียว
• นำตัวอย่างที่สนใจจะหาลำดับเบส มาสกัดสารพันธุกรรม
• เตรียม Library (Library Construction) จากสารพันธุกรรมที่ได้จากตัวอย่าง โดยสารพันธุกรมจะถูกตัดเป็นชิ้นเล็กๆ จากนั้นเชื่อมกับ adapters

 ภาพ 3 GeneMind libraries sample with P5/P7 adaptor 

• เมื่อนำ Library ไปติดกับ Solid Surface และทำการเพิ่มปริมาณเพื่อเพิ่มสัญญาณที่จะทำให้สามารถตรวจวัดได้ ดีเอ็นเอจะเกิดการโค้งงอและยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell เรื่อยๆ เรียกกระบวนการนี้ว่า Clonal amplification

 ภาพ 4 Library ซึ่งติดกับ Solid Surface และกระบวนการเพิ่มปริมาณเพื่อเพิ่มสัญญาณที่จะทำให้สามารถตรวจวัดได้

• หาลำดับเบสของ DNA ทั้งหมดโดย Sequencing by Synthesis (SBS) เป็นเทคนิคการหาลำดับเบสของ DNA โดยใช้หลักการเติมนิวคลีโอไทด์ทีละตัวเข้ากับสายแม่แบบ และใช้เอนไซม์ DNA polymerase ในการสังเคราะห์สายใหม่ ระหว่างกระบวนการนี้จะมีการปลดปล่อยสารหรือสัญญาณที่สามารถตรวจจับได้ 
• สามารถอ่านลำดับได้ทั้งแบบ single-end หรือ paired-end ซึ่งช่วยให้วิเคราะห์ genome, transcriptome, หรือ mutations ได้อย่างละเอียด

 ภาพ 4 Sequencing by Synthesis (SBS)

ในการทดสอบทางพันธุกรรมทั้ง NGS และ dPCR มีบทบาทที่แตกต่างกันตามลักษณะของการทดสอบและความต้องการของข้อมูลที่ต้องการวิเคราะห์

มาดูกันว่าทั้งสองเทคโนโลยีแตกต่างกันอย่างไรในบริบทของการทดสอบแต่ละแบบ  

1. NIPT (Non-Invasive Prenatal Testing)

การทดสอบคัดกรองความผิดปกติของโครโมโซมในทารก โดยใช้ cfDNA จากเลือดแม่

• NGS ใน NIPT:
• ใช้การทำ massively parallel sequencing เพื่อวิเคราะห์ cell-free fetal DNA (cffDNA) ในกระแสเลือดของแม่ โดยจะนับจำนวนของแต่ละโครโมโซมเพื่อตรวจหาความผิดปกติ เช่น Trisomy 21 (ดาวน์ซินโดรม), Trisomy 18, และ Trisomy 13
  • สามารถตรวจสอบโครโมโซมทั้งหมดได้ในครั้งเดียว (Genome-wide screening)
  • ตรวจจับ rare chromosomal abnormalities ได้ดีกว่า
• dPCR ใน NIPT:
  • ใช้ dPCR เพื่อเพิ่มความแม่นยำในการตรวจหาการเพิ่มหรือลดของโครโมโซมเป้าหมาย เช่น Trisomy 21 โดยการคำนวณจำนวนโมเลกุลของโครโมโซมเฉพาะเทียบกับโครโมโซมปกติ
    • แม่นยำสูง สำหรับการตรวจหาความผิดปกติที่รู้จักแล้วต้องระบุเป้าหมายที่ต้องการตรวจล่วงหน้า

2. PGT-A (Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy)

การทดสอบคัดกรองความผิดปกติของจำนวนโครโมโซมในตัวอ่อนก่อนย้ายฝังในกระบวนการ IVF

• NGS ใน PGT-A:
  • ใช้ low-pass whole genome sequencing เพื่อตรวจสอบการมีหรือไม่มีของโครโมโซม (aneuploidy) เช่น monosomy, trisomy, และ segmental aneuploidy ในตัวอ่อน
    • ตรวจสอบความผิดปกติของโครโมโซม ทั้ง genome ได้ละเอียดมาก
    • สามารถตรวจหาความผิดปกติขนาดเล็ก (sub-chromosomal) เช่น deletions หรือ duplications ได้
• dPCR ใน PGT-A:
  • ใช้ตรวจสอบเฉพาะโครโมโซมที่มีโอกาสผิดปกติสูง เช่น โครโมโซม 21, 18, 13 หรือโครโมโซมเพศ
    • ใช้เวลาน้อยและแม่นยำสำหรับเป้าหมายที่ระบุชัดเจน ต้องเลือกเป้าหมายเฉพาะ 

3. Carrier Screening

การทดสอบเพื่อตรวจหาผู้ที่เป็นพาหะของโรคทางพันธุกรรมแบบยีนเดี่ยว (เช่น Cystic Fibrosis, Thalassemia)

• NGS ใน Carrier Screening:
  • ใช้ targeted gene panels หรือ whole-exome sequencing (WES) เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ในยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคทางพันธุกรรมต่างๆ
    • ตรวจสอบได้หลายยีนในครั้งเดียว (multiplexing)
    • สามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ใหม่ๆ ที่ไม่รู้จักมาก่อน
• dPCR ใน Carrier Screening:
  • ใช้สำหรับตรวจหาการกลายพันธุ์เฉพาะที่ทราบอยู่แล้ว เช่น CFTR mutations ในโรค Cystic Fibrosis หรือการกลายพันธุ์ใน HBB gene สำหรับ Thalassemia
    • แม่นยำสูงในการตรวจหาการกลายพันธุ์ที่ทราบอยู่แล้ว
    • จำกัดเฉพาะการกลายพันธุ์ที่รู้จักแล้ว ไม่สามารถตรวจหาการกลายพันธุ์ใหม่ๆ ได้ 

4. Oncology

การตรวจวินิจฉัยและติดตามโรคมะเร็ง

• NGS ใน Oncology:
• ใช้สำหรับการทำ comprehensive profiling ของเนื้องอกเพื่อหาการกลายพันธุ์, การแปรผันของจำนวนสำเนา (CNV), การสับเปลี่ยน (translocations), และ gene fusions
• ทำ Whole Exome Sequencing (WES) หรือ targeted gene panels เพื่อตรวจสอบการกลายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง เช่น TP53, KRAS, EGFR, BRAF เป็นต้น
• ใช้ในการตรวจ Tumor Mutational Burden (TMB) และ Microsatellite Instability (MSI) เพื่อการบ่งชี้การรักษา (เช่น การตอบสนองต่อ immunotherapy)
• การวิเคราะห์เนื้องอกทั้ง genome หรือ exome: ตรวจหาการกลายพันธุ์ทั้งที่รู้จักและไม่รู้จัก
• Liquid Biopsy: ตรวจ circulating tumor DNA (ctDNA) ในเลือดเพื่อติดตามการตอบสนองต่อการรักษาหรือการกลับมาของมะเร็ง
• การเลือกการรักษาแบบเฉพาะบุคคล (Precision Medicine): ค้นหาการกลายพันธุ์ที่สามารถตอบสนองต่อการรักษาเป้าหมาย (targeted therapy)
  • วิเคราะห์ข้อมูลที่หลากหลายและครอบคลุม (genome-wide analysis)
  • ตรวจจับการกลายพันธุ์หายากและ novel mutations

• dPCR ใน Oncology:
• ใช้สำหรับการตรวจสอบการกลายพันธุ์เฉพาะที่รู้จักอยู่แล้วใน DNA ของเนื้องอกหรือ circulating tumor DNA (ctDNA) ในเลือด
• มีความแม่นยำสูงในการตรวจหาการกลายพันธุ์ที่มีปริมาณน้อยมาก (rare mutations) เช่น EGFR T790M ในมะเร็งปอด หรือ KRAS mutations ในมะเร็งลำไส้ใหญ่
• Liquid Biopsy: ตรวจสอบ minimal residual disease (MRD) หลังการรักษาเพื่อตรวจหาการกลับมาของมะเร็ง
  • ความไวและความแม่นยำสูงในการตรวจหา low-frequency mutations
  • ตรวจสอบได้เฉพาะการกลายพันธุ์ที่ทราบอยู่แล้วเท่านั้น
  • ไม่สามารถวิเคราะห์การกลายพันธุ์ที่ครอบคลุมได้เหมือน NGS

5. Copy Number Variation (CNV)

CNV คือการแปรผันของจำนวนสำเนาของยีนหรือส่วนของโครโมโซม ซึ่งอาจมีผลกระทบต่อการเกิดโรค รวมถึงมะเร็ง

NGS ใน CNV Detection:

• NGS ใน CNV Detection:

• ใช้ depth of coverage (จำนวนการอ่านซ้ำในบริเวณยีน) ในการประเมินการเพิ่มหรือลดของสำเนายีน
• สามารถทำการวิเคราะห์ CNV ได้ในระดับ genome หรือใช้ targeted sequencing panels ที่มียีนเกี่ยวข้องกับโรคหรือมะเร็ง
• สามารถตรวจสอบ CNV ขนาดเล็กหรือที่ซับซ้อนได้ (sub-microscopic CNV)
• วิเคราะห์ CNV ร่วมกับการกลายพันธุ์แบบ point mutations ในการทดสอบเดียวกันได้

• dPCR ใน CNV Detection:

• ใช้การแบ่งตัวอย่าง DNA ออกเป็นหลายส่วนย่อยและทำการขยายเพื่อวัดปริมาณสำเนายีนที่เฉพาะเจาะจง
• การตรวจวัด CNV เปรียบเทียบกับยีนอ้างอิง (reference gene) เพื่อระบุการเพิ่มหรือลดจำนวนสำเนา
• แม่นยำสูงและไวในการตรวจหาการแปรผันของจำนวนสำเนาในยีนเฉพาะ
• ใช้เวลาน้อยและต้นทุนต่ำสำหรับการตรวจเป้าหมายเฉพาะ

สรุปความแตกต่างในการใช้ NGS และ dPCR ในแต่ละการทดสอบ

ข้อสรุปการเลือกเทคโนโลยี

✨ NGS
✅ ต้องการตรวจหา การกลายพันธุ์แบบไม่เจาะจง
✅ ต้องการ ข้อมูลพันธุกรรมเชิงลึก
✅ ตัวอย่างมีความหลากหลายและซับซ้อน

🔹dPCR
✅ ต้องการตรวจ การกลายพันธุ์เฉพาะจุดที่รู้ตำแหน่ง
✅ ต้องการ ความแม่นยำสูง สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ
✅ ตัวอย่างมีปริมาณจำกัด

การเลือกใช้ขึ้นอยู่กับ วัตถุประสงค์การวิเคราะห์ งบประมาณ และ ความซับซ้อนของการตรวจ หากต้องการผลลัพธ์ที่ครอบคลุมและแม่นยำ อาจเลือกใช้ NGS ก่อน เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ที่น่าสนใจ แล้วใช้ dPCR ในขั้นตอนถัดไปเพื่อตรวจสอบเชิงปริมาณในตัวอย่างที่มีเป้าหมายเฉพาะ 🎯