DNA methylation

                 เป็นกลไกการใส่หมู่ methyl (methylation) ของ DNA เกิดที่ตำแหน่ง CpG nucleotide ซึ่งเป็นตำแหน่งที่ลำดับเบส cytosine (C) อยู่ต่อหน้า guanine (G) ซึ่งบริเวณที่มี CpG nucleotide นี้ อยู่อย่างหนาแน่นเรียกว่า CpG island โดยมักพบภายในบริเวณ transcription promoter ของ DNA ในเซลล์ปกตินั้น การเกิด methylation มักจะเกิดที่ cytosine บริเวณที่มีรหัสของยีน แต่ไม่พบที่ตำแหน่ง promoter บน CpG island เมื่อตำแหน่งของ CpG island เกิดการ methylation ขึ้น จะทำให้หยุดการ transcription ของ promoter นั้นๆ การเกิด DNA methylation จะเป็นการปรับเปลี่ยนตำแหน่ง cytosine ให้เป็น 5-methylcytosine (5mC) โดยการเติมกลุ่ม methyl ที่ตำแหน่ง C-5 ของ cytosine residue ซึ่งอาศัยเอนไซม์ DNA methyltransferase (DNMT) หลังจากนั้น CpG island ที่ถูก methylation แล้วจะเป็นตำแหน่งที่เหมาะสมที่ methylated DNA binding proteins เช่น MECP2 มาจับ ซึ่งโปรตีนเหล่านี้ มักจะมีคุณสมบัติที่หยุดการเกิด transcription (transcriptional co-repressors) หลังจากนั้นจะทำ ให้เกิด histone modification ต่อไป เช่น เกิดการยึดจับของ histone deacetylases (HDAC) ซึ่งนำ ไปสู่การขดตัวของโครมาตินทำ ให้ transcription factor ต่างๆ ไมjสามารถเข้าจับได้ ซึ่งจะทำให้ยีนนั้นไม่มีการแสดงออก (gene silencing) ดังแสดงในรูป

                       นอกจากการเกิด DNA methylation แล้ว ยังมีการใส่หมู่ methyl กับโปรตีน histone ตำแหน่งที่สำคัญ ได้แก่ histone H3 lysine9 (H3K9)6 ซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนด้วย DNA methylation ที่ตำแหน่ง promoter ที่เป็น เป้าหมายนั้นมีความสำคัญมากในการควบคุมการเจริญเติบโตโดย เฉพาะเซลล์เม็ดเลือด โดยจะถูกควบคุมผ่านทาง growth factor, cytokine และโมเลกุลอื่นๆ ในโรคมะเร็งพบว่ามีการเปลี่ยนแปลงของ DNA methylation แบบซับซ้อน โดยรวมแล้วจะเป็นลักษณะของการเกิด methylation โดยรวมพร้อมๆกันทุกตำแหน่ง พบการการเพิ่มขึ้นของ DNMTs และ การเกิด methylation ในตำแหน่ง CpG ที่ไม่มีการ methylation มาก่อน

Methylation-specific PCR

                       Methylation-specific PCR เป็นเทคนิค PCR ที่ใช้ตรวจหาความผิดปกติหรือโรคที่มี methylation บนสายดีเอ็นเอแตกต่างกัน หลักการของการทำ methylation-specific PCR ใช้การปรับเปลี่ยนโครงสร้างดีเอ็นเอในเบส C (cytosine) ที่มี 2 แบบ คือ แบบที่มีการเติมหมู่เมธิล (methylation) และแบบที่ไม่มีการเติมหมู่เมธิล โดยการทำเริ่มต้นด้วยขั้นตอน Bisulfite modification ซึ่งในขั้นตอนนี้เบส C ที่ไม่มีการเติมหมูเมธิลจะถูกเปลี่ยนโครงสร้างโดย bisulfite ไปเป็นเบส U (uracil) แต่ถ้าเบส C นั้นมีการเติมหมู่เมธิลอยู่จะไม่ถูกเปลี่ยนเป็นเบส U หลังจากการทำ Bisulfite modification จะทำให้ดีเอ็นเอที่ได้มีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันไปขึ้นกับสายดีเอ็นเอที่มี methylation ที่ต่างกัน แล้วนำมาออกแบบไพรเมอร์ให้มีความจำเพาะและมีขนาดที่ต่างกันสำหรับการทำปฏิกิริยา PCR

การตรวจวิเคราะห์ DNA Methylation ด้วยเทคนิค MassARRAY

                       สามารถตรวจวิเคราะห์ระดับปริมาณการเติมหมู่เมธิล (Quantitative Methylation) ตรงบริเวณ CpG บนสาย DNA ที่มีขนาดความยาว 200-600 คู่เบส โดยสามารถตรวจวิเคราะห์ระดับการเปลี่ยนแปลงปริมาณการเติมหมู่เมธิลที่พบตั้งแต่ 5% ขึ้นไป ประกอบด้วยขั้นตอน ดังนี้

1. Bisulfite Treatment

เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเบส C ที่ไม่มีการเติมหมู่เมธิลกับเบส C ที่มีการเติมหมู่เมธิลบนสาย DNA โดยเบส C ที่ไม่มีหมู่เมธิลจะเปลี่ยนเป็นเบส U ในขณะที่เบส C ที่มีหมู่เมธิลอยู่จะยังคงเป็นเบส C เช่นเดิม

2. PCR Amplification

โดยการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมบริเวณตำแหน่งเป้าหมาย (target regions) ด้วย reverse primers ที่ติด T7-promoter tag และ forward primers

3. SAP Treatment

เพื่อกำจัด dNTPs ส่วนเกินที่เหลือจากการทำ PCR Amplification

4. In Vitro RNA Transcription

สำหรับสังเคราะห์ RNA ขึ้นมา โดยใช้ nucleotide bases เป็น rA, rG, rU และ dC หากตำแหน่ง C ตรงบริเวณ CpG บนสาย DNA เกิด methylation ขึ้น คือ มีการเติมหมู่เมธิล ดังนั้นเมื่อเกิด transcription ขึ้นตำแหน่งดังกล่าวซึ่งอยู่บนสาย RNA จะเป็นเบส G แต่หากไม่ได้เกิด methylation ตำแหน่งดังกล่าวจะเปลี่ยนเป็นเบส A แทน

5. Cleavage

โดยใช้เอนไซม์ RNAase เพื่อตัดสาย RNA ตรงตำแหน่งทางฝั่ง 5’ ของเบส U  ทำให้เกิดชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) ขึ้น ซึ่งจำนวนชิ้นส่วนรวมถึงขนาดความยาวและน้ำหนักมวลโมเลกุลของแต่ละชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) นั้นขึ้นอยู่กับลำดับเบสบนสาย RNA

6. MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

สามารถตรวจวิเคราะห์ระดับปริมาณการเกิด methylation โดยอาศัยการตรวจวิเคราะห์ชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) ซึ่งมีความแตกต่างของน้ำหนักมวลโมเลกุลระหว่างชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) ที่เกิดจาก DNA บริเวณ CpG ตรงตำแหน่งที่มีการเติมหมู่เมธิล (methylation) เปรียบเทียบกับบริเวณเดียวกันที่ไม่มีการเติมหมู่เมธิล (non-methylation) โดยมีน้ำหนักมวลโมเลกุลแตกต่างกัน 16 ดาลตันต่อ 1 ตำแหน่งบนบริเวณ CpG ยกตัวอย่างเช่น ถ้าชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) ที่เกิด methylation 2 ตำแหน่งจะมีน้ำหนักมวลโมเลกุลมากกว่าชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) ที่ไม่ได้เกิด methylation เท่ากับ 32 ดาลตัน เป็นต้น ทั้งนี้เนื่องจากชิ้นส่วน RNA (RNA fragments) ที่มาจาก methylated DNA ตรงตำแหน่ง C บริเวณ CpG ของ DNA จะเป็นเบส G บนสาย RNA มีน้ำหนักมวลโมกุลมากกว่าเบส A ซึ่งอยู่บนสาย RNA ที่มาจาก non-methylated DNA เท่ากับ 16 ดาลตัน

          โดยการชุดตรวจมะเร็งที่เป็นชุดสำเร็จรูป สำหรับเทคนิค MassARRAY ได้แก่ MLH1 Methylation Panel และ MGMT Methylation Panel