จากตอนที่แล้วการศึกษา Multi-omics profiling of virus infection ทำให้ทราบถึงโปรไฟล์ของแฟคเตอร์สำคัญสำหรับกลไกหรือกระบวนการที่เกิดขึ้นระหว่างร่างกายมนุษย์และไวรัส SARS-CoV-2 หรือ COVID-19 ไปแล้ว สำหรับตอนที่ 2 นี้ จะกล่าวถึงในส่วนของการศึกษาการทำงานและความสัมพันธ์ของโปรตีนบนไวรัส SARS-CoV-2 จากกระบวนการ Post Translational Modifications (PTM) และ Pathway analysis
การศึกษาตำแหน่ง Post Translational Modification
Post Translational Modification (PTM) คือ กระบวนการดัดแปลงโมเลกุลของโปรตีนหลังการถอดรหัส มีความสำคัญต่อการทำงานของโปรตีน เนื่องจากการเกิด PTM สามารถเกิดได้หลากหลายรูปแบบ ขึ้นกับหน้าที่และการทำงานของโปรตีนนั้นๆ การหาตำแหน่ง (site) ของ PTM ในการศึกษานี้ ใช้ข้อมูลจากการทำนายชนิดโปรตีนของเซลล์ไวรัสและโฮสต์ และตำแหน่งที่เกิดความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน (interactome) ของเซลล์ทั้งสอง โดยเริ่มจากการหาจำนวนตำแหน่ง PTM ทั้งหมดที่เกิดขึ้นของเซลล์ไวรัสบนโฮสต์ จากนั้นทำการเลือกศึกษาเพียงตำแหน่งที่มี PTM สองรูปแบบหลักคือ ตำแหน่งที่มีการเติมโปรตีนยูบิควิติน (ubiquitination site) และตำแหน่งที่เติมหมู่ฟอสเฟต(phosphorylation site)
เนื่องจาก PTM ทั้งสองรูปแบบนั้น เกิดขึ้น ณ โปรตีนโครงสร้างหลักของ SARS-CoV-2 ซึ่งตามข้อมูลโครงสร้างจีโนมของเชื้อ SARS-CoV-2 ระบุว่า ประกอบไปด้วย (1) โปรตีน Nucleocapsid (N) ซึ่งเป็นโปรตีนที่จับบนจีโนมของไวรัสเพื่อช่วยปกป้อง RNA ภายในไวรัส, (2) โปรตีน spike (S) เป็นส่วนที่ยื่นออกมาจากเปลือกนอกของไวรัส มีลักษณะคล้ายหนามเพื่อใช้ยึดเกาะกับเซลล์โฮสต์และมีความสำคัญในการก่อโรคในมนุษย์ (3) โปรตีน NSP2 และ NSP3 (NSP: Non-Structural Protein) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการ Replication ทำหน้าที่ในการเพิ่มจำนวนไวรัส
ภาพที่ 1 ไดอะแกรมแสดง whole genome ของเชื้อ SARS-CoV-2
(ที่มา: หมานมานะ และคณะ (2563))
เมื่อเปรียบเทียบตำแหน่งที่มีการเติมโปรตีนยูบิควิตินบน Nucleocapsid (N), spike (S), NSP2 และ NSP3 ระหว่างไวรัสชนิด SARS-CoV-2 และ SARS-CoV พบว่ามีจำนวนตำแหน่งดังกล่าวแตกต่างกัน (รูป c) ซึ่งแสดงถึงการเปลี่ยนแปลงของโปรตีน (cellular proteins) และการทำงานภายในเซลล์ที่แตกต่างกันของไวรัสทั้งสอง นอกจากนี้ยังพบการเติมหมู่ฟอสเฟตบนตำแหน่ง M, N, S, NSP3 และ ORF9b (รูป f) ของไวรัสแต่ละชนิด ซึ่งเป็น recognition motifs หรือตำแหน่งจดจำที่เกี่ยวข้องกับกลไกการทำงานของ RNA ที่จะเป็นตัวควบคุมการแปรรหัสเป็นโปรตีนชนิดต่างๆ ฉะนั้นการทราบถึงการแปรผันของโปรตีนในตำแหน่งเหล่านี้จะเป็นข้อมูลสำคัญสำหรับการพัฒนาการรักษาแบบ Targeted Pan-antiviral ที่จำเพาะเจาะจงต่อการต้านไวรัสต่อไป
ภาพที่ 2 แสดงจำนวนตำแหน่ง PTM สำหรับ ubiquitination (รูป c) และphosphorylation (รูป f) และตำแหน่งที่เกิด ubiquitination (red circle), phosphorylation (purple square) ของ SARS-CoV-2/SARS-CoV บน โปรตีนโครงสร้างหลัก Spike (รูป e) และ Nucleocapsid (รูป g)
การสืบหาการทำงานของ SARS-CoV-2 ผ่าน Pathway-enrichment analysis
จากข้อมูลของโปรตีนสำคัญที่ปรากฏใน phosphorylation และ ubiquitination ทำให้สามารถสืบหากลไกการทำงานและปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลของไวรัสกับโฮสต์ได้จากการวิเคราะห์ Pathway-enrichment ซึ่งการวิเคราะห์ Pathway-enrichment เกิดจากการเชื่อมโยงข้อมูล ทั้งข้อมูลระดับการแสดงออกของยีนที่ควบคุมโปรตีนสำคัญ ที่ทำให้ทราบว่าโปรตีนใดบ้างที่มีการแสดงออกหรือถูกกดการแสดงออก และข้อมูล PTM รวมไปถึงข้อมูลปฏิสัมพันธ์ระดับโมเลกุลของการก่อเชื้อไวรัสทั้ง SARS-CoV-2 และ SARS-CoV ที่เกิดขึ้นในโฮสต์มา Mapping กับ pathway database และเครือข่ายการสื่อสารและส่งสัญญาณระหว่างเซลล์ (the global network of cellular interactions) เพื่อให้ทราบถึงข้อมูลของโปรตีนเหล่านั้น ว่าเกิดขึ้นที่กระบวนการใดในร่างกาย
โดยผลการศึกษาพบการแสดงออกของกลไกที่ยับยั้งการทำงานของ ORF3 protein ซึ่งเป็นโปรตีนสำคัญ และ HOPS complex หรือโปรตีนเชิงซ้อนที่สามารถรวมตัวกับสารประกอบอื่นที่ไม่ใช่โปรตีน โดยโปรตีนทั้ง 2 ชนิดนี้เป็นตัวเชื่อมโยงไปยังโปรตีนอื่นๆ บนเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีน เมื่อถูกยังยั้งการทำงานจึงส่งผลกระทบต่อโปรตีนตัวอื่นๆ ให้หยุดทำงานไปด้วย (รูป b,c) ซึ่งตรวจสอบได้จากการพบการสะสมของโปรตีน MAP1LC3B ที่ทำหน้าที่เป็น โปรตีนตัวรับในกระบวนการกินตัวเองของเซลล์ (autophagy receptors) ซึ่งส่งผลต่อการกำจัดโปรตีนที่ไม่ได้ทำงานทิ้งโดยการกินตัวเอง เมื่อ ORF3 protein และ HOPS complex หยุดทำงาน คาดว่าเป็นผลทำให้ร่างกายมีระดับการสะสมที่มากขึ้นของ APOB protein ดังรูป c โดยเป็นโปรตีนที่เหนี่ยวนำให้เกิดภาวะเสี่ยงต่อการเกิดโรคหลอดเลือดแดงอุดตัน (Arterial Thrombosis) ซึ่งเป็นภาวะแทรกซ้อนที่มีส่วนทำให้ปอด หัวใจและไตล้มเหลว ตามที่พบอาการในผู้ป่วย COVID-19
ภาพที่ 3 แสดงความสัมพันธ์โปรตีน ORF3 และ HOPS complex ที่ส่งผลต่อโปรตีนอื่นๆ (รูป b, สีเทาแสดงถึงโปรตีนที่ถูกยับยั้งการทำงาน และสีเขียวคือโปรตีนที่ยังทำงาน) โดยแสดงวิถีปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนตามรูป c และ รูป d แสดงการทำงานของโปรตีน ORF8 ที่ร่วมกับ factor อื่นๆ ในกระบวนการกินตัวเองของเซลล์ (autophagy) และการส่งสัญญาณของโปรตีนเหนี่ยวนำ TGF-β (Growth factor) ไปยังโปรตีนเป้าหมาย ECM
นอกจากนี้ยังพบการทำงานของโปรตีน ORF8 ใน SARS-CoV-2 ที่เป็นสาเหตุของการเพิ่มขึ้นในกระบวนการ phosphorylation ของโปรตีนใน MAPK signaling ที่ควบคุมการทํางานของเซลล์ ซึ่งส่งผลต่อปริมาณโปรตีน kinase ที่เป็น receptor จาก tyrosine kinase signaling หรือกระบวนการที่มีบทบาทสำคัญมากในวิถีการส่งสัญญาณภายในเซลล์ ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้การทำงานของ TGF-β and EGFR pathways ที่เกี่ยวข้องกับการผลิตและส่งออกโปรตีน ฉะนั้นจึงส่งผลโดยตรงต่อการเพิ่มจำนวนของไวรัส (virus replication) ซึ่งถือว่าเป็น pathway เด่นสำหรับโรค COVID-19
ฉะนั้นการได้มาของข้อมูลโปรตีนและบทสรุปของการทำงานภายในเซลล์ จะเกิดขึ้นไม่ได้หากขาดเทคโนโลยีที่มีประสิทธิภาพและความแม่นยำสูงในการหาลำดับโปรตีน เช่น เครื่อง High Resolution Mass Spectrometer เทคโนโลยี Orbitrap รวมไปถึงโปรแกรมที่ช่วยแปลผลการวิเคราะห์และเชื่อมโยงความสัมพันธ์ของโปรตีนอย่างเช่น Proteome discoverer ที่มาช่วยตอบโจทย์การวิจัยและพัฒนาการรักษาต่อไป
เค้าโครงแปลจากวารสาร Nature; Alexey S. et al. Multilevel proteomics reveals host perturbations by SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Nature volume 594, pages246–252 (2021)