Binary Vs Quaternary HPLC Pump   บทความโดย  

ใกล้จะสิ้นสุดปี 2017 ก้าวเข้าสู่ปี 2018 เต็มทีแล้ว สำหรับผู้อ่านคอลัมน์ของทางบริษัทหลายๆท่านอาจวางแผนท่องเทียงในวันคริสมาสต์ บางท่านอาจไปเคาต์ดาวน์ไกลๆ ก็ขอให้เดินทางอย่างปลอดภัยและสุขสันต์กับวันส่งท้ายปีอย่างมีความสุขนะครับ..

สำหรับคอลัมน์เรื่องน่ารู้ในวันนี้จะหยิบยกปัญหาโลกแตก ระหว่างปั้ม Binary และ Quaternary ของ HPLC มาเรียนรู้กันครับ!!

 World's Best UHPLC :  Vanquish (Thermo Scientific)

ก่อนที่จะทราบถึงจุดดีและจุดด้อยของทั้งสองเทคโนโลยี เรามารู้จักหลักการทำงานของทั้งสองระบบกันก่อนดีกว่าครับ 

Binary หรือสามารถเรียกได้อีกชื่อคือ High Pressure Mixing Gradient ปั้มทั้งสองจะดูด Mobile Phase จากขวด จากนั้นจึงทำการผสม Mobile Phase ที่อัตราส่วนที่ได้ตั้งไว้ โดยปัจจุบันผู้ผลิตเกือบทุกเจ้าได้ใช้อุปกรณ์ที่เรียกว่า Mixer ในการผสม โดยช่องว่างในท่อนับจากมิกเซอร์จนถึงปากทางคอลัมน์จะถูกเรียกว่า Dwell Volume หรือบางคนอาจเรียกว่า Delay Volume นั่นเอง

Quaternary หรือสามารถเรียกอีกชื่อคือ Low Pressure Mixing Gradient ปั้มเพียงตัวเดียวจะดูด Mobile Phase จากขวดโดยอัตราส่วนในการดูดจะถูกกำหนดผ่านทาง Proportional Valve จากนั้นอัตราส่วนที่กำหนดไว้จะถูกผสมกันหลัง Proportional Valve ก่อนจะไหลไปเข้าสู่ปากทางคอลัมน์ ในบางครั้งเราอาจพบอุปกรณ์ที่ใช้ลดสัญญาณรบกวนเนื่องจาก Proportional Valve และผลจากการผสมสาร ที่เรียกว่า Pulse Dampener เพิ่มเข้ามาด้วย สำหรับค่า Dwell Volume ของระบบนี้ จะต้องพิจารณาถึงช่องว่างในท่อ นับตั้งแต่จาก Proportional Valve ถึง Head Pump และช่องว่างใน Head Pump ไปถึงปากคอลัมน์ โดยหากมี Pulse Dampener ซึ่งมีลักษณะเป็นขดท่อแบบคอยล์ก็จะต้องบวกเพิ่มเข้าไปอีก รวมถึงอาจมี Mixer ช่วยในการผสมเพิ่มเติมก็ต้องรวมช่องว่างดังกล่าวเข้าไปด้วยเช่นกัน ดังนั้น Dwell Volume ของระบบนี้จะมีค่ามากกว่าระบบ High Pressure อย่างมาก

อย่างไรก็ตาม มิใช่ว่า Binary จะดีกว่า Quaternary เสียทั้งหมด เนื่องจากทั้งสองระบบมีส่วนดี และส่วนด้อยที่ต้องพิจารณาดังนี้

(อย่าลืมนะว่า เราพูดถึงเกรเดียนท์ อย่างเดียวนะครับ หากวิเคราะห์แบบ Isocratic ไม่มีความแตกต่างใดๆเลยสำหรับสองระบบนี้)

1. จำนวน Mobile Phase

- แม้ว่า Quaternary สามารถใช้ Mobile Phase ได้มากที่สุด 4 ชนิด และ Binary สามารถใช้ Mobile Phase ได้มากสุด 2 ชนิด แต่ด้วยเทคโนโลยีในปัจจุบันของการผลิตคอลัมน์ให้เลือกใช้ จึงดูเหมือนว่างานทั่วๆไปเกือบทั้งหมดในปัจจุบัน นิยมใช้ Mobile Phase กันมากสุดก็แค่สองชนิด ดังนั้นกรณีของจำนวนของ Mobile Phase จึงถือให้เสมอกันครับ อีกทั้งด้วยการใส่ Solenoid Valve ลงในปั้ม ทำให้ระบบ Binary สามารถเตรียม Mobile Phase ได้สี่ขวดเช่นเดียวกัน (แต่เลือกใช้ได้แค่ครั้งละสองขวดเท่านั้นนะ) **ถ้าในแง่ของ Method Development ซึ่งใช้การผสม Mobile Phase ในสัดส่วนที่แตกต่างกัน  Quaternary จะถือไพ่เหนือกว่าทันทีครับ

2. Dwell Volume

- ห้าปีก่อน ผู้ผลิตยี่ห้อต่างๆ จากใช้ค่านี้ในการล็อกสเปค เนื่องจากได้เคลมว่าค่านี้ยิ่งต่ำยิ่งดี จากค่าประมาณ 600-1,000 ไมโครลิตร บางผู้ผลิตลดลงเหลือแค่ 90-120 ไมโครลิตร ดังนั้นก่อนอื่นเรามาทำความเข้าใจค่า Dwell volume ให้ถ่องแท้ก่อนดีกว่า

Dwell Volume เป็นค่าที่บ่งบอกถึงช่องว่างในท่อรวมถึงในชิ้นส่วนต่างๆก่อนเข้าสู่ปากทางคอลัมน์ หากค่านี้มากนั่นหมายถึงว่า Mobile Phase ที่ไหลมาต้องใช้เวลานานมากขึ้นกว่าจะเข้าสู่คอลัมน์ ระบบเกรเดียนท์ที่ตั้งไว้ใน Method ก็ย่อมช้ากว่าที่ตั้งไว้ นั่นหมายถึงระยะเวลาที่ใช้ในการ re-equilibrate แต่ละการฉีดตัวอย่างย่อมใช้เวลานานขึ้นด้วย

ประเด็นสำคัญที่ควรเข้าใจ : ระยะเวลาในการ re-quilibration หลังจากการรันตัวอย่างเสร็จ จนถึงก่อนฉีดตัวอย่างถัดไป จะส่งผลอย่างมากต่อระบบ UHPLC เนื่องจากระบบ UHPLC หลายๆครั้งมีระยะเวลาในการวิเคราะห์ค่อนข้างสั้นเพียงแค่ 1-2 นาที หากมีค่า dwell volume มาก การ re-equilibrate ก็ต้องใช้เวลานาน เช่น 1-2 นาที ซึ่งไม่เหมาะสมเพราะผู้วิเคราะห์เลือกใช้ UHPLC เพื่อต้องการประหยัดเวลาและ Mobile Phase มากที่สุด (UHPLC หรือ HPLC ไม่ใช่ดูจากเครื่องนะครับ แต่เป็น Method ที่ใช้ในการวิเคราะห์ และคอลัมน์ที่เลือกใช้) ดังนั้นหากวิเคราะห์แบบ HPLC ค่า Dwell volume แทบจะไม่มีความหมายใดๆเลย

เรื่องตลกที่ไม่ตลกของ Dwell Volume : อย่างที่ได้เกริ่นไปตอนต้น สักห้าปีก่อน ผู้ผลิตแต่ละเจ้าพยายามลดค่านี้ลงเพื่อล็อกสเปคเครื่อง แต่ที่เคลมว่าค่านี้ยิ่งต่ำยิ่งดีจริงหรือไม่ ลองพิจารณาเหตุผลเหล่านี้ดูครับ

1. เมื่อลดค่านี้ลง การผสมของ Mobile Phase ดีเหมือนเดิมหรือไม่ เข้ากันได้ดีหรือเปล่า ? - คำตอบชัดเจนครับว่ายิ่งลดค่าดังกล่าว การผสมของ Mobile Phase แย่ลง สิ่งที่ตามมาคือ reproducibility จะแย่มาก ยิ่งถ้ามีกรดอยู่ในระบบ Mobile Phase ดังนั้นบางเจ้าจึงต้อง * ว่า 90 ไมโครลิตร กรณีไม่มีกรดเท่านั้น เป็นต้น

2. เมื่อของเหลวสองชนิดหรือมากกว่าผสมกัน มีหลักการทางฟิสิกส์ที่เรียกว่า Molal Volume  (ถ้ามีโอกาสครั้งหน้าผู้เขียนจะเล่าให้ฟังครับ) แปลเป็นไทยง่ายๆว่า น้ำ 50 มล. ผสมกับ เมทานอล 50 มล. ได้สารละลายไม่เท่ากับ 100 มล.นั่นเอง ดังนั้นปริมาตรหลังจากการผสมจึงเปลี่ยนแปลงไป แน่นอนว่า Flow Rate จึงไม่เท่ากับที่ตั้งไว้ บางครั้งการผสมกันกลายเป็นปฏิกิริยาคายความร้อนบ้าง ดูดความร้อนบ้าง บางครั้งมีฟองอากาศเกิดขึ้น เนื่องจากสมบัติ Compressibility ของของเหลวเอง ค่าเหล่านี้ล้วนส่งผลต่อการวิเคราะห์ทั้งสิ้น โดยส่งผลโดยตรงกับเบสไลน์ ยิ่งมีพื้นที่หลังผสมก่อนถึงปากคอลัมน์น้อย ยิ่งส่งผลมากต่อเบสไลน์

3. ด้วยเหตุผลทั้งสองข้อด้านต้น หลังจากนั้นผู้ผลิตทุกยี่ห้อไม่เอาค่า Dwell Volume มาเคลมว่ายิ่งน้อยยิ่งดีอีกเลย ปัจจุบันค่า Dwell Volume จึงกลับมาที่ประมาณ 600-1,000 ไมโครลิตรเช่นเดิม เนื่องจากเพิ่มระยะท่อให้ Mobile Phase ผสมกันดีขึ้น หรือไม่ก็กลับไปใส่ Mixer ได้เช่น 75 ไมโครลิตร 350 ไมโครลิตรเป็นต้น

-ดังนั้น จึงขอสรุปว่า Dwell Volume ปั้มชนิด Binary ทำได้ดีกว่า แต่ควรเลือกใช้ขนาด Mixer ให้เหมาะสม เพื่อ reproducibility ที่ดี และเหมาะสมกับระยะเวลา re-equilibrate ด้วย

 จากรูปสีแดงคือ Binary ที่ไม่ใช้ Mixer ส่วนสีน้ำเงินคือ Binary ที่ใช้ Mixer ขนาดที่เหมาะสม

3.Pressure Generate

- การผสมแบบ High Pressure Mixing เป็นการอัดฉีด Mobile Phase อย่างแรงให้ผสมกัน ส่วนหนึ่งเพื่อลด Dwell Volume ให้นึกถึงว่าถ้าเราจะผสมน้ำหวานกับน้ำเปล่า หากค่อยๆริน กับฉีดจากกระบอกอัดให้ผสมกัน แน่นอนว่า การผสมกันแบบรุนแรงย่อมเข้ากันได้อย่างดีกว่า ดังนั้นภาระในการอัดฉีดจึงอยู่ที่ปั้ม ย่อมทำให้ค่าใช้จ่ายในการบำรุงรักษาสูงมากกว่า Low Pressure Mixing อย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ ดังนั้นในข้อนี้ จึงยกให้  Low Pressure Mixing เหนือกว่าในแง่ค่าใช้จ่ายในการบำรุงรักษา

4.Separation

- การ Separation ในบางกรณีพบว่า การที่สารที่สนใจมีค่า Rt ใกล้เคียงกันมาก พบว่า Dwell volume ยิ่งต่ำทำให้การแยกพีคสารทำได้แย่ลง ยิ่งหากเป็นการ Transfer Method มาจาก HPLC เป็น UHPLC ด้วยเหตุผลดังกล่าวในกรณีที่เกิดเหตุการณ์แบบนี้ Low Pressure Mixing ทำได้ดีกว่าครับ

 จากรูปสีฟ้ามีค่า Delay Volume ที่มากทำให้สารออกช้ากว่าสีส้ม แต่ค่า Rs หรือ Separation Resolution ที่ได้สูงกว่า

5.Gradient Precision/Accuracy

- ความถูกต้องและความแม่นยำในการผสม ลองมาดูกรณีศึกษากันครับ หากต้องการอัตราส่วนการผสมเป็น 90:10 (A:B) ด้วยอัตราการไหล 1 มล.ต่อนาที 

ระบบ Binary

ปั้ม A จะทำการดูด Mobile Phase A จำนวน 900 ไมโครลิตร, ปั้ม B จะดูด Mobile Phase จำนวน 100 ไมโครลิตรผสมกัน ความแม่นยำและความถูกต้องจะขึ้นกับระบบ Check Valve, ข้อต่อ, ขนาดหน้าตัดท่อ เป็นต้น

ระบบ Quaternary

สมมุติว่า Pump Head มีปริมาตร 100 ไมโครลิตร นั่นคือใน 1 นาทีจะต้องทำงาน 10 รอบ ใน 1 รอบปั้มจะดูด Mobile Phase A จำนวน 90 ไมโครลิตรผสมกับ Mobile Phase B จำนวน 10 ไมโครลิตร แสดงว่าความแม่นยำและความถูกต้องจะมีตัวแปรเพิ่มขึ้นมาคือการทำงานของ Proportional Valve เป็นต้น

- สรุปในหัวข้อนี้ Binary จะทำได้ดีกว่า Quaternary ครับ

6.Baseline

- เนื่องจากการผสมสารแบบ High Pressure Mixing เกิดจากการดูด Mobile Phase มาโดยตรง โดยมากจึงมักไม่มี Online-Degassor แบบ Low Pressure Mixing อีกทั้งเพื่อเป็นการลด Delay Volume จึงทำการถอด Pulse Dampener ออก ซึ่งส่งผลทำให้เบสไลน์ไม่นิ่งแบบ Low Pressure Mixing 

7.Cost

- ค่อนข้างชัดเจนในข้อนี้เนื่องจาก Binary ใช้ปั้ม 2 ตัว ส่วน Quaternary ใช้ปั้มเพียงตัวเดียว ดังนั้นราคาของ Binary System จึงแพงกว่า

ดังนั้นจึงขอสรุปทางเลือกในการเลือกซื้อระหว่างปั้ม Binary และ Quaternary ดังนี้ครับ

1. หากการใช้งานเครื่องหลักเป็นการใช้งานที่ต้องการความยืดหยุ่นในการทำ Method Development หรือเป็นงานที่ต้องอ้างอิงจาก Method มาตรฐานเช่น USP หรือ AOAC ซึ่งส่วนใหญ่เป็นระบบของ HPLC ดังนั้น Low Pressure Mixing จึงเป็นทางเลือกที่ดีกว่าครับ

2.ถึงแม้จะมีระบบโปรแกรมในการ Transfer Method จาก HPLC->UHPLC ก็ตาม แต่ไม่มีอะไรการันตีได้ว่า Method ปัจจุบันซึ่งส่วนใหญ่ล้วนมาจากการพัฒนาบน Low Pressure Mixing จะสามารถปรับเปลี่ยนได้อย่างสมบูรณ์ในทุกคอนดิชั่น ดังนั้น Low Pressure Mixing UHPLC จึงเป็นทางเลือกที่ประหยัดเวลาได้ดีกว่าครับ

3.หากต้องการระบบที่มีความรวดเร็วในการวิเคราะห์ ประสงค์จะวิเคราะห์ตัวอย่างจำนวนมาก ไม่ว่าจะเป็นงาน Routine หรืองาน Screening ก็ตาม Binary Pump ดูเป็นทางเลือกที่ดีกว่าครับ

4.หากต้องการเครื่องที่ใช้งานได้อย่างอิสระ เช่นลักษณะงานแบบ Research และมี preliminary method อยู่แล้ว โดยไม่มีปัญหาเรื่องราคา Binary Pump เป็นตัวเลือกที่ดีครับ

มาถึงบรรทัดนี้ หวังว่าท่านผู้อ่านคงได้รับสาระความรู้จากทางบริษัท และหวังเป็นอย่างยิ่งว่าจะติดตามในครั้งต่อๆไป แล้วพบกันใหม่ครับ